Действие сериала официально происходит во вселенной параллельной миру оригинального мультсериала.

Лео, Раф, Майки и Донни — черепашки-мутанты, научившиеся боевому искусству ниндзюцу у своего сэнсэя — мастера Сплинтера. Выбравшись из канализации на улицы Нью-Йорка, братья оказываются в бурлящем жизнью мегаполисе. Сражаясь со Шреддером, мерзкими инопланетянами Крэнгами и толпами сверхмощных мутантов, черепашки учатся стоять друг за друга стеной. Рафаэль справляется со своей жаждой лидерства, не подкрепленной достаточными качествами, Леонардо принимает бремя ответственности, Микеланджело пытается расти интеллектуально, Донателло учится жить с неразделенной любовью к Эйприл. Так же постепенно раскрывается драма между Сплинтером, Шреддером и Караи. Присутствует вяло развивающаяся (в силу возрастной аудитории) тема отношений Эйприл и Кейси. Большое внимание сериал уделяет камео различных персонажей оригинального сериала (Кожеголовый, Крысиный Король, Мондо Гекко, Наполеон, Бибоп и Рокстеди, Фугитоид, Мона Лиза, трицератоны). Достаточно большое внимание отдано отрицательным персонажам, их историям и характерам, почти все антигерои длительное время участвуют в сериале в качестве людей и позже становятся мутантами (в отличие от оригинального сериала, где человеческие появления были эпизодичны).